Logowanie

Jak działa ocena dopasowania krzywej kalibracyjnej?

Po co w ogóle oceniać dopasowanie krzywej?

Regresja liniowa (OLS) zawsze „coś” policzy – nawet dla danych, które w ogóle nie powinny być opisywane linią prostą, albo dla których rozrzut wyników rośnie wyraźnie wraz ze stężeniem. Wysoki współczynnik R² sam w sobie nie dowodzi, że model liniowy jest odpowiedni (krzywa o łagodnej krzywiźnie też może mieć R² bliskie 1). Ten moduł sprawdza trzy niezależne, konkretne pytania, zamiast polegać wyłącznie na R²:
1. Czy krzywa jest rzeczywiście liniowa,
2. Czy rozrzut wyników jest jednorodny wzdłuż całej krzywej (a jeśli nie – czy warto przejść na regresję ważoną),
3. Czy wśród punktów są wartości wyraźnie odstające od reszty.

Osiem kombinacji modeli kalibracji – i dlaczego raport dotyczy tylko jednej

Formularz pozwala wybrać dokładnie jedną z ośmiu kombinacji (cztery przyciski modelu x checkbox „Przejście przez zero”) – raport zawsze ocenia tylko tę wybraną kombinację, nie generuje automatycznie żadnej innej do porównania. Aby zobaczyć wynik innej kombinacji, należy wygenerować raport ponownie z innym wyborem. Modele różnią się w trzech niezależnych wymiarach:

• Kształt: liniowy (y = a·x + b) albo kwadratowy (y = a·x² + b·x + c) – kwadratowy dodaje jeden stopień swobody krzywizny, przydatny np. gdy zakres pomiarowy jest szeroki i widać wyraźne odchylenie od prostej (dla przykładu: praca na GC-MS/MS często wskazuje na model kwadratowy). Dla modeli kwadratowych raport zamiast testu Mandela pokazuje test adekwatności modelu kwadratowego - mechanizm analogiczny do testu Mandela, ale o jeden stopień wyżej (kwadrat vs sześcian) – obok testu braku dopasowania, i dodaje odpowiedź na pytanie, czy krzywizna jest w ogóle potrzebna (test t dla współczynnika przy x² oraz test Mandela – patrz niżej).
• Wyraz wolny: zwykły (dopasowanie estymuje własny punkt przecięcia z osią Y) albo „przez zero” (wymuszony wyraz wolny = 0: b w modelu liniowym, c w kwadratowym; checkbox „Przejście przez zero” pod przyciskami modelu) – to drugie ma sens tylko wtedy, gdy istnieje fizyczne uzasadnienie, że odpowiedź przy zerowym stężeniu naprawdę wynosi zero. Niezależny od kształtu i od ważenia – można go zaznaczyć przy dowolnym z czterech modeli poniżej, także ważonym (WLS).
• Ważenie: zwykłe (OLS, każdy punkt ma tę samą wagę) albo ważone (WLS, punkty o niższym stężeniu dostają większą wagę – patrz „OLS czy WLS?” niżej). Model WLS wymaga dodatkowo wyboru konwencji ważenia (1/x, 1/x² lub 1/y²) – „1/x²” jest domyślna i najczęściej rekomendowana w praktyce; program pokazuje w wyniku orientacyjną wskazówkę, która konwencja najlepiej pasuje do konkretnie Twoich danych.

Program nigdy nie dobiera modelu, konwencji ważenia ani przejścia przez zero automatycznie – wybór zawsze zostaje jawną decyzją użytkownika, udokumentowaną w raporcie.

Test Mandela (liniowość)

Porównuje dopasowanie modelu liniowego z dopasowaniem modelu kwadratowego do tych samych danych – jeśli dodanie wyrazu kwadratowego istotnie poprawia dopasowanie, krzywa najprawdopodobniej nie jest liniowa. Matematyczne minimum to 4 poziomy stężenia (3 parametry modelu kwadratowego + co najmniej 1 stopień swobody), ale ISO 8466-1:2021 wymaga co najmniej 5 roztworów kalibracyjnych – przy mniejszej liczbie poziomów test wciąż się policzy, ale jego moc wykrywania krzywizny jest niska.

Test braku dopasowania (lack-of-fit)

Wymaga powtórzeń na przynajmniej części poziomów – rozkłada całkowitą resztę regresji na dwie części: „czysty błąd” (rozrzut między powtórzeniami na tym samym poziomie) i „brak dopasowania” (rozrzut między średnimi kolejnych poziomów a linią regresji). Jeśli druga część jest istotnie większa od pierwszej, wybrana krzywa nie pasuje do kształtu danych – niezależnie od tego, co pokazuje test Mandela. Liczony jest na dokładnie wybranym modelu (liniowym albo kwadratowym, z wagami i przejściem przez zero, jeśli je zaznaczono).

Czy krzywizna jest potrzebna? (modele kwadratowe)

Gdy wybrano model kwadratowy, raport dodatkowo odpowiada na pytanie, czy człon kwadratowy jest w ogóle uzasadniony, czy wystarczyłaby prosta. Służą do tego dwa narzędzia:

• Test t dla współczynnika przy x² – sprawdza, czy współczynnik przy x² różni się istotnie od zera (H₀: a = 0), z t = a / SE(a) przy liczbie stopni swobody reszt modelu. Jest liczony na dokładnie tym dopasowaniu, które wybrano (z wagami WLS i z przejściem przez zero, jeśli je zaznaczono) – to on rozstrzyga odpowiedź na postawione pytanie.
• Test Mandela – ten sam, co dla modelu liniowego (liniowy vs kwadratowy), ale tu informacyjny: liczy się go na średnich z poziomów (dla modelu ważonego – z wagami wybranej konwencji), zawsze z wyrazem wolnym, więc dla modelu przez zero nie odpowiada dokładnie wybranemu modelowi. Oba testy mogą dać różne wnioski – wtedy decyduje test t.

Brak istotnego członu kwadratowego oznacza, że prostsza krzywa liniowa może wystarczyć; wybór modelu pozostaje jednak decyzją użytkownika.

Trzy warianty testu jednorodności wariancji

Żadna norma nie narzuca jednego uniwersalnego sposobu sprawdzenia, czy rozrzut wyników jest podobny na każdym poziomie stężenia (homoskedastyczność) – dlatego moduł liczy równolegle trzy niezależne warianty, każdy z innym warunkiem brzegowym, i pokazuje wszystkie trzy w raporcie:

• Wariant A (test F, PN-ISO 8466-1) – tylko dwa skrajne poziomy (najniższy i najwyższy), wymaga ≥ 2 powtórzeń na każdym z nich. Najprostszy, ale ignoruje środkowe poziomy.
• Wariant B (test C-Cochrana) – wszystkie poziomy naraz, ale wymaga równej liczby aktywnych wyników na każdym poziomie (klasyczne założenie tego testu) – projekt niezbalansowany (np. po ręcznym wykluczeniu części wyników) automatycznie wyłącza ten wariant z raportu.
• Wariant C (test Levene'a, domyślnie w wersji Browna-Forsythe'a) – wszystkie poziomy naraz, liczba powtórzeń może być różna na różnych poziomach, ale każdy poziom musi mieć ≥ 3 aktywne wyniki (przy n = 2 statystyka Levene'a jest zdegenerowana, więc dla duplikatów służą warianty A i B) – wypełnia lukę między wariantem A i B. Wybór tego testu do oceny homoskedastyczności krzywej kalibracyjnej potwierdzony źródłem: Sanchez, J.M. (2018), „Estimating Detection Limits in Chromatography from Calibration Data: OLS vs. WLS”, Separations, 5(4), 49.

Wariant niedostępny (np. bo dane nie spełniają jego warunku brzegowego) nie oznacza błędu – po prostu dane nie pozwalają go policzyć; pozostałe warianty nadal się liczą normalnie.

OLS czy WLS?

Jeśli co najmniej jeden z trzech wariantów wykryje niejednorodną wariancję, warto rozważyć regresję ważoną (WLS) zamiast zwykłej (OLS) – w typowej sytuacji chromatograficznej/spektrofotometrycznej rozrzut wyników zwykle rośnie wraz ze stężeniem, więc zwykła regresja nieświadomie „przywiązuje” się bardziej do wysokich stężeń niż do niskich, co pogarsza dokładność właśnie w newralgicznym, niskim zakresie (blisko LOD/LOQ). Program nigdy nie przełącza automatycznie na WLS, nawet gdy wykryje heteroskedastyczność – wybór zawsze zostaje jawną decyzją użytkownika, udokumentowaną w raporcie. Włączenie WLS wymaga wyboru konwencji ważenia (1/x, 1/x² lub 1/y²) – „1/x²” jest najczęściej rekomendowana w literaturze dla typowej sytuacji, ale program pokazuje w wyniku orientacyjną wskazówkę, jaka konwencja najlepiej pasuje do konkretnie Twoich danych (oszacowaną z porównania rozrzutu na skrajnych poziomach).

Punkty odstające i korekta Bonferroniego

Każdy punkt wybranego dopasowania (OLS lub WLS, liniowego lub kwadratowego) dostaje własną „resztę studentyzowaną” (t_i) – miarę tego, jak bardzo dany wynik odbiega od linii regresji, w jednostkach odchylenia standardowego reszt. Punkt jest flagowany jako odstający, gdy |t_i| przekracza wartość krytyczną. Tu jednak pojawia się pułapka statystyczna: testujemy jednocześnie wiele punktów (nie jeden), więc gdyby użyć zwykłego progu testu pojedynczego, przy odpowiednio dużej liczbie punktów prawie zawsze któryś „przypadkiem” przekroczy granicę – nawet gdy żaden wynik naprawdę nie jest błędny. Korekta Bonferroniego zaostrza próg proporcjonalnie do liczby jednocześnie testowanych punktów N, żeby całkowite ryzyko fałszywego alarmu (dla całego zestawu, nie jednego punktu) pozostało na poziomie α – stąd wartość krytyczna |t_crit| pokazana w raporcie jest wyraźnie wyższa niż standardowy kwantyl rozkładu t-Studenta dla pojedynczego testu. Matematyczne minimum to 4 punkty (żeby po „usunięciu” jednego zostało jeszcze ≥1 stopień swobody na oszacowanie wariancji resztowej).

Przedział ufności i przedział predykcji

Oba pasma widoczne na wykresie krzywej (i w tabeli wyników raportu) pokazują niepewność wokół dopasowanej krzywej, ale odpowiadają na dwa różne pytania – to częste źródło pomyłki, więc warto je rozróżniać świadomie:

• Przedział ufności (CI) mówi, gdzie z zadanym poziomem ufności (1 − α) leży prawdziwa, nieznana linia regresji – czyli jak dokładnie sama krzywa (wyznaczona ze skończonej liczby punktów kalibracyjnych) jest oszacowana. Jest węższy, bo dotyczy tylko niepewności parametrów dopasowania (a, b, ewentualnie c) – nie uwzględnia rozrzutu pojedynczego pomiaru wokół krzywej.
• Przedział predykcji (PI) mówi, w jakim zakresie z zadanym poziomem ufności znajdzie się pojedynczy, nowy wynik pomiaru (np. odpowiedź analizatora dla kolejnej, realnie zmierzonej próbki) przy danym stężeniu. Jest zawsze szerszy od CI, bo dokłada do niepewności samej krzywej także naturalny rozrzut pojedynczego pomiaru wokół niej (wariancję resztową) – to on, nie CI, odpowiada na pytanie "czy wynik tej konkretnej próbki mieści się w oczekiwanym zakresie dla tego stężenia".

W praktyce: CI służy do oceny jakości samego dopasowania (jak precyzyjnie krzywa jest wyznaczona – węższy CI to bardziej wiarygodna krzywa), a PI do interpretacji pojedynczych wyników względem tej krzywej (np. czy odpowiedź konkretnej próbki kontrolnej jest zgodna z oczekiwaniami dla jej deklarowanego stężenia). Oba pasma są liczone na poziomie istotności α wybranym dla całej oceny (patrz „Poziom istotności” w panelu) i, tak jak reszta wyniku, wyłącznie dla wybranej kombinacji modelu – zmiana modelu (albo przejścia przez zero, albo konwencji ważenia) przelicza oba pasma od nowa.

Źródła

PN-ISO 8466-1 (test F dwupunktowy, wariant A jednorodności wariancji); Draper, N.R., Smith, H. (1998), Applied Regression Analysis, 3rd ed. (test braku dopasowania); Cochran, W.G. (1941) (wariant B); Levene/Brown-Forsythe oraz Sanchez, J.M. (2018), Separations, 5(4), 49 (wariant C – wybór testu do tego zastosowania); ICH Q2(R2), Eurachem Guide, Almeida, Castel-Branco, Falcao (2002), J. Chromatogr. B, 774, 215-222 (konwencje ważenia WLS).