Logowanie

Jak działa program „Krzywe kalibracyjne”?

Obliczenia jakich parametrów można się spodziewać?

Program oblicza liniowość/adekwatność modelu, jednorodność wariancji, punkty odstające, wybór OLS/WLS, a także dokłada do tego przeliczenie poziomów/próbek na stężenia (odzysk), zakres roboczy, Sx₀/Vx₀, opcjonalnie LOD/LOQ z krzywej, oraz panel kryteriów akceptacji.

Osiem kombinacji modeli kalibracji

Formularz pozwala wybrać dokładnie jedną z ośmiu kombinacji (cztery przyciski modelu x checkbox „Przejście przez zero”), a raport zawsze ocenia tylko tę jedną, wybraną kombinację. Modele różnią się w trzech niezależnych wymiarach: kształt (liniowy albo kwadratowy), wyraz wolny (zwykły albo wymuszony na zero) i ważenie (OLS albo WLS, z konwencją 1/x, 1/x² albo 1/y²).
Program nigdy nie dobiera żadnego z tych wyborów automatycznie.

Test Mandela, test braku dopasowania, adekwatność modelu kwadratowego

Dla modelu liniowego: test Mandela porównuje dopasowanie liniowe z kwadratowym (odpowiada na pytanie "czy krzywa jest naprawdę liniowa?). Test braku dopasowania – dla każdego modelu, liczony na dokładnie wybranym dopasowaniu (z wagami/przez zero) – rozkłada resztę regresji na „czysty błąd” i „brak dopasowania”.
Dla modelu kwadratowego: test t dla współczynnika przy x² rozstrzyga, czy krzywizna jest w ogóle potrzebna (liczony na dokładnie wybranym dopasowaniu – z wagami/przez zero, jeśli zaznaczono), a test adekwatności modelu kwadratowego (kwadrat vs sześcian – własne rozszerzenie LabStat.pl, nie stanowiące zapisu normy ISO 8466, która definiuje tylko porównanie liniowy vs kwadratowy) sprawdza, czy nie potrzeba modelu jeszcze wyższego stopnia.
Oba te testy (adekwatności i Mandela w wersji informacyjnej) liczą się na średnich z poziomów (dla modelu ważonego – z wagami wybranej konwencji), zawsze z wyrazem wolnym – dla modelu przez zero nie odpowiadają więc dokładnie wybranemu dopasowaniu, o krzywiźnie rozstrzyga wtedy test t.

Test jednoznaczności (tylko model kwadratowy)

Paraboliczna krzywa kalibracyjna ma wierzchołek – jeśli wypada on wewnątrz zakresu roboczego, dwa różne stężenia mogłyby dać tę samą odpowiedź (krzywa nie jest jednoznacznie odwracalna na całym swoim zakresie). Ten test (ISO 8466-2:2001) sprawdza położenie wierzchołka względem zakresu i ostrzega, gdy to zagrożenie istnieje.

Trzy warianty testu jednorodności wariancji i OLS/WLS

Moduł liczy równolegle trzy niezależne warianty testu homoskedastyczności (wariant A – test F na dwóch skrajnych poziomach, wariant B – test C-Cochrana, wariant C – test Levene'a/Browna-Forsythe'a), każdy z innym warunkiem brzegowym – wariant niedostępny nie oznacza błędu, po prostu dane nie pozwalają go policzyć. Jeśli co najmniej jeden wariant wykryje niejednorodną wariancję, warto rozważyć regresję ważoną (WLS) – program nigdy nie przełącza na WLS automatycznie.

Odzysk (odwrotna predykcja) na poziomach kalibracji i próbkach nieznanych

Dla każdego poziomu kalibracyjnego i każdej próbki nieznanej moduł wykonuje odwrotną predykcję – odwraca dopasowaną krzywą (metodą bisekcji, na przedziale predykcji) i wylicza stężenie odzyskane (x̂) z jego niepewnością (Δx). Dla poziomów kalibracyjnych (znane stężenie nominalne) liczony jest dodatkowo odzysk:

Kluczowa zasada: wynik leżący poza ścisłym zakresem kalibracji nie dostaje żadnej liczby (brak ekstrapolacji, zgodnie z ISO/IEC 17025 i wytycznymi Eurachem) – dostaje tylko jawny powód w kolumnie „Status” (np. „poza zakresem kalibracji”). Wymagane jest wtedy rozcieńczenie i ponowna analiza próbki albo rozszerzenie krzywej o kolejny poziom.

Niepewność względna (%) poziomu kalibracyjnego jest liczona względem jego stężenia nominalnego, a próbki nieznanej – względem stężenia odzyskanego:

Dla poziomu kalibracyjnego prawdziwe stężenie jest znane, a x̂ jest tylko jego oszacowaniem obciążonym błędem – dzielenie przez x̂ mieszałoby precyzję z odzyskiem, a przy najniższych poziomach (gdy x̂ wypada blisko zera albo poniżej) dawałoby wartości rzędu tysięcy procent. Tak samo liczą względne miary precyzji normy (V_x0 wg DIN 32645 i ISO 8466-1) i tak samo moduł Budżet niepewności przypisuje u_cal do stężenia. Dla próbki nieznanej x̂ jest jedyną znaną wartością, więc to ona jest mianownikiem (GUM). Niepewność jest miarą precyzji oszacowania, niezależną od tego, czy odzysk (poprawność) wypadł dobrze czy źle – to drugie widać osobno, w kolumnie odzysku.

Zakres roboczy poziomów kalibracji

Ostatnia kolumna tabeli odwrotnej predykcji oznacza, czy dany poziom mieści się w zakresie roboczym według kryteriów, które użytkownik sam zaznaczył: zakresu z metody medianowej ISO 8466-1, orientacyjnego zakresu odzysku AOAC i tolerancji niepewności. Poziom jest „w zakresie roboczym”, gdy spełnia wszystkie zaznaczone kryteria; w przeciwnym razie raport podaje, które z nich nie zostało spełnione (np. „odzysk 37,5 % poza 80–110 %”). Bez zaznaczenia żadnego z tych kryteriów kolumna pozostaje pusta (—).

Zakres roboczy wg ISO 8466-1 (metoda medianowa)

Norma liczy nachylenie każdego odcinka między dwoma sąsiednimi poziomami kalibracji i porównuje je z medianą wszystkich takich nachyleń (mediana, nie średnia – żeby jeden nietypowy odcinek nie „przeciągał” punktu odniesienia). Nachylenie odcinka to lokalna czułość metody w tym miejscu krzywej; odchylenie od mediany pokazuje, o ile ten odcinek różni się od typowego nachylenia całej krzywej (np. spłaszczenie przy wysokich stężeniach).

Sx₀/Vx₀ (DIN 32645 / ISO 8466-2)

Sx₀ to odchylenie standardowe metody wyrażone w jednostkach stężenia (sigma/nachylenie), a Vx₀ to jego współczynnik zmienności (%) – miara precyzji metody wokół środka krzywej. Dla modelu liniowego liczone wg DIN 32645, dla modelu kwadratowego wg rozszerzenia z ISO 8466-2:2001 (rozdz. 5.4, nachylenie lokalne w środku zakresu):

LOD/LOQ z krzywej kalibracyjnej (opcjonalnie, tylko model liniowy)

Trzy równoległe, równie uznane sposoby oszacowania σ (norma dopuszcza wszystkie trzy w tej samej sekcji, 3.2.3.3), łączone z tym samym wzorem:

Domyślnie k_DL = 3,3 i k_QL = 10 (ICH Q2(R2) 2023) – z wyjątkiem źródła „niepewność standardowa wyrazu wolnego”, gdzie domyślne k_DL = 6,0 (Mocak i in., 1997), a k_QL pozostaje 10 – patrz „Mnożnik k dla LOD” w formularzu.

• Odchylenie resztowe (S_y/x) – domyślne, liczone z samej krzywej, bez osobnej próby ślepej; ta sama wartość pośrednia, którą wykorzystuje Sx₀/Vx₀ tej krzywej (metodologicznie spójne w jednym raporcie).
• Odchylenie standardowe próby ślepej – wymaga osobnej serii powtórzeń próby ślepej (niezależnej od krzywej – nie wiersza o stężeniu 0 w tabeli poziomów, bo wiele procedur nie zaleca nanoszenia zera na krzywą).
• Niepewność standardowa wyrazu wolnego (SD intercept) – trzecie źródło σ, liczone z tej samej regresji.

Przy powtórzeniach na poziomach odchylenie resztowe to odchylenie pojedynczego pomiaru wokół krzywej (powtarzalność w poziomie i rozrzut średnich poziomów wokół krzywej), a niepewność wyrazu wolnego liczona jest ze średnich poziomów – tak samo jak w programie LOD/LOQ, więc z tych samych danych oba programy dają te same wyniki.

Ta metoda dotyczy wyłącznie nieważonego modelu liniowego (OLS) – zakłada jedno, stałe nachylenie na całej krzywej, którego model kwadratowy z definicji nie ma, i regresję nieważoną (tak jak Sx₀/Vx₀).

Odzysk w orientacyjnym zakresie AOAC

Po wybraniu kategorii stężenia (np. „10 ppm”), raport pokazuje orientacyjny zakres dopuszczalnego odzysku dla tego poziomu koncentracji z tabeli AOAC (Horwitza), ale wyłącznie informacyjnie, jedna kategoria na całą krzywą (nie dla każdego poziomu). Bez wybranej kategorii ta sekcja jest po prostu niedostępna – program nigdy nie zgaduje kategorii z rzędu wielkości stężenia.

Jak wybrać kategorię AOAC?

Kategorię wybiera się według stężenia analitu w próbce badanej, wyrażonego jako ułamek masowy – nie według stężenia roztworu wzorca użytego do wzbogacenia. Przy próbce z własnym tłem analitu bierze się łączną zawartość (tło + dodatek). Dla wody i rozcieńczonych roztworów wodnych przyjmuje się gęstość ≈ 1, czyli 1 mg/L ≈ 1 mg/kg ≈ 1 ppm i 1 µg/L ≈ 1 ppb.

Tabela ma tylko poziomy co dekadę i AOAC nie opisuje interpolacji. Dla wartości pomiędzy wierszami wybiera się wiersz najbliższy w skali logarytmicznej; w połowie wielkości (np. 3·10⁻⁵) zakresy sąsiednich wierszy się różnią, więc warto zapisać w procedurze przyjętą zasadę – bezpieczniejszy jest wiersz o niższym stężeniu (szerszy zakres) albo konsekwentnie „rząd wielkości w dół”. Referencja AOAC ma charakter wyłącznie informacyjny: jeżeli dla danej dziedziny obowiązuje przepis (np. SANTE dla pozostałości pestycydów: 70–120 %), stosuje się kryterium z przepisu. Kolumna RSD_r podaje orientacyjną powtarzalność oczekiwaną na danym poziomie.

W tym module wybiera się jedną kategorię dla całej krzywej: przyjmij poziom, na którym krzywa jest najczęściej używana (zwykle środek zakresu roboczego), wyrażony jako zawartość analitu w próbce. Gdy zakres krzywej obejmuje kilka wielkości, pamiętaj, że dla wyższych poziomów kryterium AOAC jest węższe.

Tolerancja dla niepewności (poziomy i próbki nieznane)

Gdy podasz próg (%), raport konfrontuje go z niepewnością względną (patrz wzór U_% wyżej), już policzoną bez warunków dla każdego poziomu kalibracyjnego i każdej próbki nieznanej:

Poziomy kalibracyjne i próbki nieznane są liczone osobno (dwa niezależne podsumowania „X z Y w tolerancji”) – to są dwie różne rzeczy: poziomy mówią o precyzji samej metody na całym zakresie, próbki nieznane o niepewności konkretnego wyniku, który trafia do klienta. Dokładnie tak jak zakres AOAC wyżej, ten próg jest wyłącznie informacyjny i zawsze wybierany przez użytkownika – bez podanej wartości sekcja jest po prostu niedostępna.

Dlaczego program nie wystawia jednej oceny krzywej?

Dla wielu z powyższych testów (zwłaszcza modeli kwadratowych) nie istnieje jedna, jednoznaczna, uniwersalnie obowiązująca reguła akceptacji – normy różnią się, edycje norm się zmieniają, a niektóre testy (adekwatność kwadratu, zakres roboczy) są z natury opisowe, nie binarne. Dlatego silnik liczy wszystkie potrzebne liczby bez warunków, a to użytkownik, w panelu „Kryteria akceptacji krzywej” świadomie wybiera, które z nich mają się liczyć do wniosku tego konkretnego raportu. Raport zestawia wynik każdego wybranego kryterium (np. „krzywizna nieistotna, PG = 0.436 ≤ F_crit = 10.128”); decyzję o przyjęciu krzywej podejmuje laboratorium.

Punkty odstające, przedział ufności i przedział predykcji

Każdy punkt dostaje własną resztę studentyzowaną z korektą Bonferroniego (test wielokrotny, nie pojedynczy). Przedział ufności (CI) mówi, jak dokładnie jest wyznaczona sama krzywa; przedział predykcji (PI) mówi, w jakim zakresie znajdzie się nowy, pojedynczy wynik pomiaru przy danym stężeniu – to PI, nie CI, stoi za odzyskiem i granicami zakresu kalibracji w tabelach wyżej.

Źródła

PN-ISO 8466-1 (test F dwupunktowy, wariant A, zakres roboczy §5.3.3); ISO 8466-2:2001 (PN-ISO 8466-2:2004, model kwadratowy, test jednoznaczności, Sx₀/Vx₀); Draper, N.R., Smith, H. (1998), Applied Regression Analysis, 3rd ed. (test braku dopasowania); DIN 32645 (Sx₀/Vx₀, model liniowy); ICH Q2(R2) (2023) / Q2(R1) (2005) (LOD/LOQ z krzywej); AOAC/Horwitz (orientacyjny zakres odzysku).